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ELISA检测体例利用

文章种别:常识百科| 宣布日期:2013.11.09

体例一:

用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体浓缩至卵白质含量为1~10μg/ml。在每一个聚苯乙烯板的反映孔中加0.1ml,4℃ 留宿。第二天,弃去孔内溶液,用洗濯缓冲液洗3次,每次3分钟。简称洗濯,下同。2. 加样:加必然浓缩的待检样品0.1ml于上述已包被之反映孔中,置37℃ 孵育1小时。而后洗濯。同时做空缺孔,阳性对比孔及阳性对比孔。3. 加酶标抗体:于各反映孔中,插手新颖浓缩的酶标抗体经滴定后的浓缩度0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时,洗濯。4. 加底物液显色:于各反映孔中插手姑且配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。5. 停止反映:于各反映孔中插手2M硫酸0.05ml。6. 成果鉴定:可于红色背景上,间接用肉眼察看成果:反映孔内色彩越深,阳性水平越强,阳性反映为无色或极浅,根据所呈色彩的深浅,以“+”、“-”号表现。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm若以ABTS显色,则410nm处,以空缺对比孔调零后测各孔OD值,若大于划定的阳性对比OD值的2.1倍,即为阳性。

ELISA检测体例利用

体例二:

用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原浓缩至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃留宿。第二天洗濯3次。加必然浓缩的待检样品未知抗体0.1ml于上述已包被之反映孔中,置37℃孵育1小时,洗濯。同时做空缺、阳性及阳性孔对比于反映孔中,插手新颖浓缩的酶标第二抗体抗抗体0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗濯,最初一遍用DDW洗濯。其他步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

注重事变:

1. 正式尝试时,应别离以阳性对比与阳性对比节制尝试前提,待检样品应作一式二份,以保障尝试成果的精确性。偶然本底较高,申明有非特同性反映,可接纳羊血清、兔血清或BSA等封锁。

2. 在ELISA中,停止各项尝试前提的挑选是很主要的,此中包含:(1)固相载体的挑选:很多物资可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其情势能够是凹孔平板、试管、珠粒等。今朝经常利用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不论何种载体,在利用前都可停止挑选:用等量抗原包被,在统一尝试前提下停止反映,察看其显色反映是不是均一性,据此判明其吸附机能是不是杰出。(2) 包被抗体或抗原的挑选:将抗体或抗原吸附在固相载体外表时,请求纯度要好,吸附时普通请求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时候及其卵白量也有必然影响,普通多接纳4℃ 18~24小时。卵白质包被的最适浓度需停止滴定:即用差别的卵白质浓度0.1、1.0和10μg/ml等停止包被后,在别的尝试前提不异时,察看阳性标本的OD值。挑选OD值最大而卵白量起码的浓度。对大都卵白质来讲凡是为1~10μg/ml。

3 酶标记抗体任务浓度的挑选:起首用间接ELISA法停止开端效价的滴意见酶标记抗体部份。而后再牢固别的前提或采用“方阵法”包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体别离为差别的浓缩度在正式尝试体系里精确地滴定其任务浓度。

4 酶的底物及供氢体的挑选:对供氢体的挑选请求是价廉、宁静、有较着地显色反映,而自身无色。有些供氢体如OPD等有潜伏的致癌感化,应注重防护。有前提者应利用不致癌、活络度高的供氢体,如TMB和ABTS是今朝较为对劲的供氢体。底物感化一段时候后,应插手强酸或强碱以停止反映。凡是底物感化时候,以10-30分钟为好。底物利用液必须新颖配制,特别是H2O2在临用前插手。




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